激光共聚焦顯微鏡是一種先進(jìn)的細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)分析儀器，它在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，并使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理。以下是激光共聚焦顯微鏡的觀察方式介紹：

一、基本原理

激光共聚焦顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場(chǎng)光源和局部平面成像模式，采用激光束作為光源，激光束經(jīng)照明針孔，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上。組織樣品中如果有可被激發(fā)的熒光物質(zhì)，受到激發(fā)后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測(cè)針孔時(shí)先聚焦，聚焦后的光被光電倍增管（PMT）探測(cè)收集，并將信號(hào)輸送到計(jì)算機(jī)，處理后在計(jì)算機(jī)顯示器上顯示圖像。

二、觀察方式

點(diǎn)照明與點(diǎn)探測(cè)

激光光源通過照明針孔發(fā)射出的光，聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上。

該點(diǎn)所發(fā)射的熒光在探測(cè)針孔上成像，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測(cè)針孔阻擋。

照明針孔與探測(cè)針孔對(duì)被照射點(diǎn)或被探測(cè)點(diǎn)來說是共軛的，因此被探測(cè)點(diǎn)即共焦點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面即共焦平面。

掃描成像

計(jì)算機(jī)以“像點(diǎn)”的方式將被探測(cè)點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上。

為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上進(jìn)行逐點(diǎn)、逐行、逐面的快速掃描。

通過控制調(diào)焦深度，可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過計(jì)算機(jī)分析和模擬，就能顯示所觀察表面的立體結(jié)構(gòu)。

三維圖像重建

激光掃描共聚焦顯微鏡具有細(xì)胞“CT”功能，可以在不損傷細(xì)胞的情況下，獲得一系列光學(xué)切片圖像。

通過“Z-Stack”模式，可以確定光學(xué)切片的位置及層數(shù)，并啟動(dòng)掃描，*終獲得三維圖像。

時(shí)間序列圖像獲取

“Time-Series”功能可以自動(dòng)在實(shí)驗(yàn)者規(guī)定的時(shí)間內(nèi)按照設(shè)定的時(shí)間間隔獲取圖像。

只需設(shè)定所需的時(shí)間間隔以及所需圖像數(shù)量，即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這對(duì)于熒光漂白恢復(fù)和鈣離子成像等實(shí)驗(yàn)非常實(shí)用。

三、應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

高分辨率與高對(duì)比度

激光共聚焦顯微鏡比普通熒光顯微鏡獲得更高對(duì)比度、高分辨率圖像。

能夠?qū)?xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行清晰成像。

多重?zé)晒庥^察

可以實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r(shí)觀察，并可形成清晰的三維圖像。

實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)

可進(jìn)行活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)，如測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣變化、pH變化、膜電位變化等。

無損傷檢測(cè)

對(duì)檢測(cè)樣品無損傷，具有良好的可靠性和重復(fù)性。

四、應(yīng)用領(lǐng)域

激光共聚焦顯微鏡在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，包括但不限于：

細(xì)胞或亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究

檢測(cè)蛋白質(zhì)、抗體及其他大分子

檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞器的觀察和測(cè)定（線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體）

檢測(cè)細(xì)胞融合

觀測(cè)細(xì)胞骨架

檢測(cè)細(xì)胞間隙連接通訊

檢測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)脂肪

細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)的三維重構(gòu)

綜上所述，激光共聚焦顯微鏡以其獨(dú)特的觀察方式和廣泛的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，在生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。