激光共聚焦顯微鏡對于樣品的要求及制備方法因樣品類型的不同而有所差異。以下是對不同類型樣品的要求及制備方法的詳細(xì)介紹：

一、樣品要求

生物樣品

熒光表達(dá)：對于需要觀察熒光標(biāo)記的樣品，應(yīng)先在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)是否正常，以確定是否有必要使用激光共聚焦顯微鏡。

蓋玻片厚度：蓋玻片的厚度要求≤0.17mm，以確保成像質(zhì)量。

激發(fā)/發(fā)射波長：明確樣品的激發(fā)波長和發(fā)射波長，以便選擇合適的激光器進(jìn)行成像。

掃描參數(shù)：對于需要重構(gòu)的樣品，應(yīng)明確掃描區(qū)域大小、位置以及Z步進(jìn)等參數(shù)，這些參數(shù)會影響測試時(shí)間。

樣品固定：共聚焦的標(biāo)本B須貼壁良好，不能懸浮起來。樣品需要在載玻片上固定好后送樣測試。

抗熒光淬滅劑：做顯微成像時(shí)，樣品需要加抗熒光淬滅劑，并固定蓋玻片。

材料樣品

樣品制備：主要測試偏材料的樣品，樣品應(yīng)提前制備好。

尺寸與顏色：拍出來*大面積為1.11×1.8mm到5×5mm范圍內(nèi)，顏色可調(diào)。樣品的尺寸沒有具體要求，但B須平整。

二、制備方法

組織切片樣品

組織采集與固定：

采用液氮冷凍法或多聚甲醛（PFA）固定法采集和固定組織。

液氮冷凍法：將新鮮組織放入液氮中保存。

多聚甲醛固定法：將組織塊置于4%PFA中進(jìn)行后固定，時(shí)間根據(jù)組織塊大小和致密程度調(diào)整。

冷凍包埋與切片：

使用冷凍切片機(jī)將組織切成5~15μm的切片。

冷凍方法包括氣體CO2冷凍包埋法、干冰冷凍包埋法、液氮冷凍法和直接冷凍法。

免疫熒光標(biāo)記：

將冷凍組織切片進(jìn)行免疫熒光抗體標(biāo)記。

使用熒光顯微鏡觀察標(biāo)記是否成功，然后移至激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行掃描成像。

細(xì)胞培養(yǎng)樣品

熒光表達(dá)載體的構(gòu)建與導(dǎo)入：

構(gòu)建綠色熒光融合蛋白表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入到培養(yǎng)細(xì)胞中。

常用的轉(zhuǎn)染方法有磷酸鈣轉(zhuǎn)染法和脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法。

細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：

將培養(yǎng)的細(xì)胞鋪在含有玻璃片的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。

在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，繼續(xù)培養(yǎng)1~2天，使GFP標(biāo)記的蛋白表達(dá)水平達(dá)到能被熒光顯微鏡檢測的水平。

免疫熒光染色：

使用預(yù)冷的PBS緩沖溶液洗滌細(xì)胞，去除殘留的培養(yǎng)液。

加入4%多聚甲醛（PFA）固定液進(jìn)行固定。

使用Triton X-100處理細(xì)胞，通透細(xì)胞膜。

在含有1%BSA的PBS溶液中孵育細(xì)胞，封閉細(xì)胞和玻璃片。

加入一抗和二抗進(jìn)行結(jié)合，并使用熒光標(biāo)記的染料進(jìn)行染色。

*后使用封片劑封片，準(zhǔn)備進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察。

三、其他類型樣品的制備方法

菌液/污泥/污水類樣品：

離心得到菌體沉淀，根據(jù)需要進(jìn)行死活染色或ROS染色。

樣品需加冰袋泡沫盒4℃保存，不與冰袋直接接觸。

生物膜樣品：

樣品表面應(yīng)平整，標(biāo)出拍攝面。

加冰袋泡沫盒4℃保存，不與冰袋直接接觸。

若在爬片上培養(yǎng)生物膜，可將爬片粘于培養(yǎng)皿底部，充滿培養(yǎng)基后封口膜密封保存。

植物類樣品：

可進(jìn)行簡單冰切及刀切處理。

加冰袋泡沫盒4℃保存，不與冰袋直接接觸。

與細(xì)胞共培養(yǎng)的樣品：

根據(jù)樣品類型和與細(xì)胞的作用方式確定送樣量和制樣要求。

提供清楚激發(fā)/發(fā)射波長、拍攝類型（2D/3D）、拍攝倍數(shù)等要求。

綜上所述，激光共聚焦顯微鏡對于不同類型樣品的要求及制備方法有所不同。在制備樣品時(shí)，應(yīng)根據(jù)樣品的類型和實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的方法和步驟進(jìn)行操作。