激光共聚焦顯微鏡是一種高分辨率的顯微鏡技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域，能夠觀察樣品的熒光標(biāo)記、三維結(jié)構(gòu)等。以下是對(duì)激光共聚焦顯微鏡樣品的要求及制樣方法的詳細(xì)介紹：

一、樣品要求

生物樣品

熒光表達(dá)：生物樣品應(yīng)先在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)是否正常，以確定是否有必要使用激光共聚焦顯微鏡。

蓋玻片厚度：要求≤0.17mm。

激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)：需明確激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。

掃描參數(shù)：若需重構(gòu)，需明確掃描區(qū)域大小、位置、Z步進(jìn)，這些參數(shù)會(huì)影響測(cè)試時(shí)間。

標(biāo)本狀態(tài)：樣品必須貼壁良好，不能懸浮，并需要在載玻片上固定好后送樣測(cè)試。

顯微成像：樣品需要加抗熒光淬滅劑，蓋玻片需要固定。

材料樣品

測(cè)試范圍：樣品拍出來(lái)*大面積為1.11×1.8mm到5×5mm范圍內(nèi)，顏色可調(diào)。

尺寸要求：樣品的尺寸沒(méi)有嚴(yán)格要求，但必須平整。

其他樣品

對(duì)于固體類(lèi)直接拍攝樣品，建議長(zhǎng)寬不超過(guò)20mm，厚度不超過(guò)10mm，重量不超過(guò)10g，并標(biāo)出測(cè)試面。

微米材料直接拍攝類(lèi)建議進(jìn)行云視頻溝通，且微粒尺寸不低于5微米。

二、制樣方法

組織切片樣品

組織采集：根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和目的采集組織，可采用液氮冷凍法或多聚甲醛（PFA）固定法。

冷凍包埋：使用氣體CO2冷凍包埋法、干冰冷凍包埋法、液氮冷凍法或直接冷凍法進(jìn)行組織冷凍，然后用冷凍切片機(jī)切成5~15μm的切片。

免疫熒光標(biāo)記：將切片進(jìn)行免疫熒光抗體標(biāo)記，標(biāo)記成功后用熒光顯微鏡觀察，確認(rèn)后再移至激光共聚焦顯微鏡掃描成像。

細(xì)胞培養(yǎng)樣品

熒光表達(dá)載體的構(gòu)建與導(dǎo)入：通過(guò)PCR擴(kuò)增目的蛋白的cDNA，接入到熒光蛋白表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，然后導(dǎo)入到培養(yǎng)細(xì)胞中。

細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：按照標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并在適當(dāng)時(shí)間進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

免疫熒光染色：使用預(yù)冷的PBS緩沖溶液洗滌細(xì)胞，去除殘留的培養(yǎng)液，然后進(jìn)行固定、通透、封閉、抗體結(jié)合、洗滌和封片等步驟。

其他樣品

菌液/污泥/污水類(lèi)樣品：進(jìn)行離心處理后，根據(jù)需要進(jìn)行染色和保存。

生物膜樣品：要求樣品表面平整，并標(biāo)出拍攝面，可根據(jù)需要在爬片上培養(yǎng)生物膜。

植物類(lèi)樣品：可進(jìn)行簡(jiǎn)單冰切及刀切，或進(jìn)行病理組織切片測(cè)試項(xiàng)目。

與細(xì)胞共培養(yǎng)的樣品：根據(jù)樣品類(lèi)型和與細(xì)胞的作用方式，進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚砗椭茦印?/span>

三、注意事項(xiàng)

樣品在制備和保存過(guò)程中應(yīng)避免污染和損壞。

不同類(lèi)型的樣品可能需要使用不同的熒光染料和標(biāo)記方法。

在進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察前，應(yīng)確保樣品已經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚砗凸潭ā?/span>

激光共聚焦顯微鏡的使用需要專(zhuān)業(yè)知識(shí)和技能，應(yīng)由專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行操作和維護(hù)。

綜上所述，激光共聚焦顯微鏡對(duì)樣品的要求和制樣方法因樣品類(lèi)型而異。為確保觀察結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，必須嚴(yán)格按照規(guī)定的步驟和要求進(jìn)行制樣操作。