超分辨率顯微鏡發(fā)展歷程 

毫無(wú)疑問(wèn)，自16世紀(jì)以來(lái)，光學(xué)顯微鏡已經(jīng)歷漫長(zhǎng)的旅程。首次被知曉的復(fù)合顯微鏡是由Zacharias和Hans Janssen構(gòu)造的。盡管這些顯微鏡沒(méi)有保存下來(lái)，但人們確信這些顯微鏡已能夠?qū)⒎糯蟊堵蕪?倍提高到9倍。17世紀(jì)末期，Leeuwenhoek首次將放大倍率和分辨率提高到細(xì)胞水平。他存留下來(lái)的顯微鏡有275倍的放大倍率和令人震驚的1μm分辨率。在19世紀(jì)晚期，Ernst Abbe發(fā)現(xiàn)光學(xué)顯微鏡的分辨率是由入射光波長(zhǎng)和顯微鏡數(shù)值孔徑的函數(shù)關(guān)系決定的。這一發(fā)現(xiàn)使分辨極限達(dá)到220nm左右。在之后的約100年內(nèi)，顯微鏡學(xué)家始終停留在這一分辨極限?？臻g分辨率的限制排除了光學(xué)顯微鏡分辨亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如核糖體、囊泡以及其他分子相互作用的可能性，這些物質(zhì)尺寸均在光學(xué)顯微鏡的分辨能力之下。

20世紀(jì)30年代后期，德國(guó)科學(xué)家Ernst Ruska發(fā)明了電子顯微鏡，它的出現(xiàn)并不久，而Max Knoll推動(dòng)其分辨率極限低至10埃左右。這是一個(gè)不可思議的壯舉。不幾年后，生物學(xué)家就開(kāi)始利用這種新型的工具。1945年3月，Keith Porter, Albert Claude和Ernest Fullam 在論文“電子顯微鏡用于組織培養(yǎng)細(xì)胞的研究”中發(fā)表了**張單個(gè)細(xì)胞的電子顯微鏡照片，文章發(fā)表在Journal of Experimental Medicine上。接下來(lái)的幾十年涌現(xiàn)出大量由生物學(xué)家利用TEM揭示詳細(xì)和復(fù)雜超微結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)工作。

然而，生物顯微鏡的目的是了解細(xì)胞存活時(shí)如何發(fā)揮機(jī)能?！凹?xì)胞生命”則是科學(xué)家為得到TEM驚人分辨率所需付出的代價(jià)。細(xì)胞樣品要求被固定、脫水、包埋于塑型劑并切成超薄切片。這就產(chǎn)生了一個(gè)高度加工和*終長(zhǎng)時(shí)間操作的樣品的二維圖像。我們花了很長(zhǎng)時(shí)間尋找合適的固定劑和緩沖劑，以*大限度地減少人工操作。同樣，利用超薄連續(xù)切片，目前三維的細(xì)胞重構(gòu)也成為可能，但數(shù)據(jù)仍然僅呈現(xiàn)一個(gè)快照的時(shí)間。而生命是動(dòng)態(tài)的，它的周期超過(guò)一個(gè)快照的時(shí)間。

接下來(lái)這一領(lǐng)域出現(xiàn)了超高分辨率顯微鏡。為充分認(rèn)識(shí)動(dòng)態(tài) 生命進(jìn)程，我們需要推進(jìn)光的分辨率極限，并將熒光和共聚焦成像的先進(jìn)技術(shù)應(yīng)用于亞細(xì)胞水平。我們需要能夠應(yīng)用于活細(xì)胞的更高分辨率。1978年，兄弟Thomashe和Christopher Cremer兩人在Microscopia Acta上發(fā)表了“對(duì)具有高分辨率和穿透深度的激光掃描顯微鏡的思考”。文章中的觀測(cè)數(shù)據(jù)開(kāi)啟了在光的衍射極限之下的觀測(cè)的大門。

超高分辨率顯微鏡的代表技術(shù)包括：STED,PALM,STORM,SIM；所有主要的顯微鏡供應(yīng)商，如萊卡、蔡司和尼康，均提供商品化超分辨率顯微鏡部件，分辨率低至20納米并非罕見(jiàn)的要求。即使是規(guī)模較小運(yùn)營(yíng)不久的公司，如猶他州的Vutara，號(hào)稱有**款3D超分辨率顯微鏡，也進(jìn)軍這一領(lǐng)域。這一分辨水平的活細(xì)胞成像變的十分普遍，在大量文獻(xiàn)中都能看到。

超分辨率顯微鏡技術(shù)原理、熒光抗體 

1873年，德國(guó)醫(yī)師Ernst Abbe 提出了“衍射極限”的概念。他預(yù)測(cè)，由于光的基本衍射性質(zhì)，光學(xué)顯微鏡無(wú)法實(shí)現(xiàn)200nm以下的分辨率。實(shí)際上，當(dāng)兩個(gè)相隔很近的物點(diǎn)同時(shí)發(fā)光時(shí)，得到的圖像是模糊的，無(wú)法分辨。超分辨率顯微鏡（SRM）的誕生打破了一個(gè)世紀(jì)多以來(lái)一直被認(rèn)為無(wú)法突破的瓶頸。 

如今，科學(xué)家們已經(jīng)研發(fā)了多種超分辨率技術(shù)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了衍射極限，能夠觀察到分子尺度的細(xì)節(jié)。SRM技術(shù)可以將細(xì)胞結(jié)構(gòu)解析為亞細(xì)胞水平，從而獲取有關(guān)細(xì)胞組分的3D結(jié)構(gòu)的信息，并可以觀察到單分子共定位。 

以下概述了時(shí)下幾種*流行的SRM技術(shù)的原理： 

1.受激發(fā)射耗竭（STED）顯微鏡 

STED對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)的熒光顯微鏡使用者來(lái)說(shuō)相對(duì)簡(jiǎn)單，該方法和普通共聚焦顯微鏡（Confocal）的原理相同。普通Confocal使用單光源，而STED使用雙光源。其中一個(gè)光源發(fā)射能激發(fā)熒光團(tuán)——熒光標(biāo)簽（研究者們以此來(lái)定位和觀察蛋白）的光，另一個(gè)光源發(fā)出不同波長(zhǎng)的光，用于抑制熒光。這束光是環(huán)形的，并且與**束光有所重疊，因此只有環(huán)形中間區(qū)域的分子會(huì)繼續(xù)發(fā)出熒光。 

獲得STED超分辨率圖片并沒(méi)有那么復(fù)雜，用戶需要仔細(xì)調(diào)整參數(shù)，才能得到漂亮的結(jié)果，否則所得圖片和普通confocal沒(méi)有差別。 

使用傳統(tǒng)和RESCue受激發(fā)射減損顯微鏡（STED）得到的細(xì)胞核膜上核孔復(fù)合體的圖片 

STED的原理： 

顯微鏡透鏡對(duì)光的衍射會(huì)導(dǎo)致來(lái)自單個(gè)點(diǎn)的光出現(xiàn)在較大的區(qū)域，這稱為點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）（見(jiàn)圖1），由于PSF的存在，使得常規(guī)顯微鏡無(wú)法達(dá)到超分辨。 

圖1：在普通光學(xué)顯微鏡中，成像是通過(guò)將來(lái)自點(diǎn)光源的光線會(huì)聚到像平面上的單個(gè)點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。超出光衍射的限制，防止了射線的精確會(huì)聚，從而導(dǎo)致物體的圖像模糊。顯微鏡的分辨率取決于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）的大小，或?qū)ο笤谀硞€(gè)點(diǎn)的三維強(qiáng)度分布。在STED中，應(yīng)用環(huán)形炸彈耗盡型激光器，其零點(diǎn)與激發(fā)激光焦點(diǎn)的*大值重疊。STED激光器引起熒光的“飽和耗盡”，從而“抑制了來(lái)自零點(diǎn)附近區(qū)域的熒光，導(dǎo)致有效PSF的尺寸減小”。

而受激發(fā)射耗竭（STED）顯微鏡通過(guò)限制樣品的熒光區(qū)域（PSF）產(chǎn)生超分辨率圖像。STED顯微鏡使用兩個(gè)重疊的激光，**個(gè)按照常規(guī)顯微鏡激發(fā)熒光團(tuán)（圖2A）。第二個(gè)激光器稱為耗盡激光器（STED激光器），它激發(fā)“甜甜圈”形狀的激光，其中心的零強(qiáng)度點(diǎn)非常小（?30 nm）（未激發(fā)）。除了在甜甜圈的中心處之外，第二激光起到了“關(guān)閉”**激光所產(chǎn)生的外圈熒光，從而將樣本激發(fā)的熒光分子范圍縮小到中心圓點(diǎn)處，這有效地降低了PSF，以產(chǎn)生非常小的單分子熒光聚焦區(qū)域，從而獲得高分辨率圖像（圖2D）。

圖2：

1. 單個(gè)小于250 nm的蛋白質(zhì)無(wú)法通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)共聚焦成像解析，從而導(dǎo)致圖像模糊

2. STED耗盡激光器產(chǎn)生了淬滅外圍熒光的“甜甜圈”

3. 飽和耗盡在功能上降低了激勵(lì)PSF

4. 隨之可以解析單個(gè)蛋白質(zhì)

適用于STED的熒光團(tuán)偶聯(lián)抗體： 

為了獲得超分辨率，染料必須具有STED激光波長(zhǎng)的高發(fā)射截面，并有效地實(shí)現(xiàn)高飽和度。這種強(qiáng)烈的照明確保了所有被STED激光“關(guān)閉”的分子都受受激發(fā)射的支配。合適的染料應(yīng)具有低的光漂白性，具有高的量子產(chǎn)率和對(duì)比度，并在目標(biāo)附近具有足夠的標(biāo)記密度。 

Jackson提供熒光染料標(biāo)記的二抗，下列染料標(biāo)記的二抗已被驗(yàn)證在STED中成功使用： AlexaFluor?488（如：115-545-003），F(xiàn)ITC（如：715-095-150），AlexaFluor?594（如：715-585-151）和AlexaFluor?647。

2. 隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM） 

*有名的“基于探針”的技術(shù)是Betzig等人研發(fā)的光激活定位顯微技術(shù)（photoactivated localization microscopy, PALM）和哈佛大學(xué)莊小威實(shí)驗(yàn)室發(fā)明的隨機(jī)光學(xué)重建顯微技術(shù)(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。*初所有的熒光標(biāo)簽都是暗的。然后使用激光脈沖來(lái)激活一小部分熒光標(biāo)簽，隨后使用另一束光來(lái)關(guān)閉這些熒光標(biāo)簽。不斷重復(fù)這個(gè)過(guò)程，生成一系列部分熒光圖，*后重建成整個(gè)視野的熒光圖。，以產(chǎn)生分辨率優(yōu)于常規(guī)方法收集的圖像。

使用超分辨率隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)，科學(xué)家首次觀察到了神經(jīng)元軸突的細(xì)胞骨架。 

Jackson提供適用于dSTORM應(yīng)用的標(biāo)記二抗，簡(jiǎn)而言之，較低強(qiáng)度的激發(fā)光激發(fā)樣品，隨機(jī)激活少量染料分子。單個(gè)發(fā)熒光的染料分子足夠分散，因此可以計(jì)算其點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的中心，從而推斷出染料的確切位置。然后使用第二激光關(guān)閉所有分子，并重復(fù)該過(guò)程。然后，通過(guò)重疊每種染料的所有映射點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)，以數(shù)學(xué)方式生成高分辨率圖像。 

用于單分子定位實(shí)驗(yàn)的熒光團(tuán)偶聯(lián)抗體 

用于單分子定位的*佳染料通常非常亮，并產(chǎn)生足夠的光子以可靠地產(chǎn)生緊密的高斯分布。Jackson ImmunoResearch提供了多種廣譜范圍內(nèi)的可靠染料，例如AlexaFluor 488，AlexaFluor 647和Cy 5，可用于這些類型的實(shí)驗(yàn)。

建議用于超分辨率顯微鏡的熒光染料偶聯(lián)物： 

每種SRM技術(shù)都有各自的探針選擇要求，Jackson ImmunoResearch提供多種已知在SRM應(yīng)用中表現(xiàn)良好的熒光標(biāo)記二抗。應(yīng)該注意的是，SRM領(lǐng)域變化迅速，因此，建議從專業(yè)技術(shù)文獻(xiàn)中尋求信息，以幫助選擇合適的熒光團(tuán)。