細(xì)菌群體生長(zhǎng)表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增加或細(xì)胞物質(zhì)的增加。測(cè)定細(xì)胞數(shù)目的方法有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法(direct microscopic count)、平板菌落計(jì)數(shù)法(plate count)、光電比油法(turbidityestimation by spectrophotometer)、*大或然數(shù)法(most probable number MPN)以及膜過(guò)濾法(membrane filtration)等。測(cè)定細(xì)胞物質(zhì)的方法有細(xì)胞干重的測(cè)定,細(xì)胞某種成分如氮的含量、RNA 和DNA 的含量測(cè)定,代謝產(chǎn)物的測(cè)定等??傊瑴y(cè)定微生物生長(zhǎng)量的方法很多,各有優(yōu)缺點(diǎn),工作中應(yīng)根據(jù)具體情況要求加以選擇。本實(shí)驗(yàn)主要介紹生產(chǎn)、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計(jì)數(shù)法。
一、目的要求
1、明確血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的原理。
2、掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。
二、基本原理
顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱(chēng)計(jì)菌器),于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。目前國(guó)內(nèi)外常用的計(jì)菌器有:血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、Peteroff-Hauser
計(jì)菌器以及Hawksley
計(jì)菌器等,它們都可用于酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等懸液的計(jì)數(shù),基本原理相同。后兩種計(jì)菌器由于蓋上蓋玻片后,總?cè)莘e為0.02mm3,而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02mm,因此可用油浸物鏡對(duì)細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。除了用這些計(jì)菌器外,還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法,此法一般用于牛乳的細(xì)菌學(xué)檢查。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速、操作簡(jiǎn)單。但此法的缺點(diǎn)是所測(cè)得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點(diǎn),如結(jié)合活菌染色微室培養(yǎng)(短時(shí)間)以及加細(xì)胞分裂抑制劑等方法來(lái)達(dá)到只計(jì)數(shù)活菌體的目的。
本實(shí)驗(yàn)以血球計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行顯微鏡直接計(jì)數(shù)。另外兩種計(jì)菌器的使用方法可參看各廠商的說(shuō)明書(shū)。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。該計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片,其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái);中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半,每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng),每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格,中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造 如圖l5-1。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格,一種是一個(gè)大方格分成25
個(gè)中方格,而每個(gè)中方格又分成16 個(gè)小方格(圖15-2);另一種是一個(gè)大方格分成16 個(gè)中方格,而每個(gè)中方格又分成25
個(gè)小方格,但無(wú)論是哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板,每一個(gè)大方格中的小方格都是400
個(gè)。每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為lmm,則每一個(gè)大方格的面積為lmm2,蓋上蓋玻片后,蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm,所以計(jì)數(shù)室的容積為0.lmm3(萬(wàn)分之一毫升)。圖15—1
血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造(一) 圖15—2 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造(二)A. 正面圖;B.縱切面圖;
放大后的方格網(wǎng),中間大方格為計(jì)數(shù)室1.血細(xì)胞計(jì)數(shù)板;2.
蓋玻片;3.計(jì)數(shù)室計(jì)數(shù)時(shí),通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù),然后求得每個(gè)中方格的平均值,再乘上25
或16,就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù),然后再換算成lml 菌液中的總菌數(shù)。設(shè)五個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A,菌液稀釋倍數(shù)為B,如果是25
個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板,則1mL 菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000A·B(個(gè))同理,如果是16 個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板,1mL
菌液中的總菌數(shù)=A/5×16×104×B=32000A·B(個(gè))
三、器材
1、菌種
釀酒酵母
2、儀器或其他用具
血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,顯微鏡,蓋玻片,無(wú)菌毛細(xì)滴管。
四、操作步驟
1、菌懸液制備
以無(wú)菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙骸?br/>2、鏡檢計(jì)數(shù)室
在加樣前,先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物,則需清洗,吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。
3、加樣品
將清潔干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片,再用無(wú)菌的毛細(xì)滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴,讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室,一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。取樣時(shí)先要搖勻菌液;加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。
4、顯微鏡計(jì)數(shù)
加樣后靜止5min,然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上,先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置,然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng),對(duì)于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊,否則視野中不易舌清楚計(jì)數(shù)室方格線,或只見(jiàn)豎線或只見(jiàn)橫線。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀,需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5~10
個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5 個(gè)中格(可選4
個(gè)角和中央的一個(gè)中格)中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽,芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí),即作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來(lái)計(jì)算樣品的含菌量。
5、清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板
使用完畢后,將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈,切勿用硬物洗刷,洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢,觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈,則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。